| Tiêu đề: Kỹ thuật tách chiết DNA
1. KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, ĐIỆN DI DNA 1.1. Tách chiết DNA Ở Eukaryote, phần DNA chủ yếu nằm trong nhân, trên các nhiễm sắc thể. Vì vậy để tách chiết DNA, trước hết cần bộc lộ DNA ra khỏi màng nhân, ra khỏi tế bào. Các bước cơ bản để tách chiết DNA gồm: Giải phóng DNA ra khỏi màng tế bào bằng cách nghiền, dùng áp xuất, siêu âm hoặc dùng phương pháp hoá học (dùng chất tẩy sodium duodecyl sulfate= sodium lauryl sulfate, triton có tác dụng phá vỡ màng tế bào, tách các phân tử lipid, đồng thời gây biến tính protein và tăng cường tính tủa protein trong quá trình tách chiết) hoặc dùng phương pháp sinh học (dùng enzym). Sau đó ly tâm để loại bỏ cặn (gồm chủ yếu mảnh vụn của tế bào). Huỷ bỏ phần protein trong tế bào, trong nhiễm sắc thể bằng proteinase K để ở 370C/1-2 giờ. Sau đó kết tủa protein bằng phenol: chlorform, NaCl… có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hòa tan DNA, sau đó ly tâm để loại phần tủa. Sau khi li tâm, protein sẽ tủa ở pha giữa: pha nước chứa DNA nằm ở trên cùng, pha dưới chứa phenol: chloroform. Thu pha nước chứa DNA.. Thông thường phenol: chloroform được trộn với tỷ lệ 1:1 hoặc 4:1 để tăng hiệu quả tủa protein. Ngoài ra còn bổ sung thêm một lượng nhỏ isoamylalcohol giúp cho phần phân tách giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ rõ hơn và thao tác sử dụng pipet để hút pha nước ở trên sẽ dễ dàng hơn. Phenol thường dễ bị xy hóa thành hợp chất quinone có màu hồng. Các hợp chất quinone có thể hình thành nên các gốc tự do làm biến tính axit nucleic. Vì vậy phenol phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng hoặc bổ sung chất chống oxy hóa như mercapthoethanol, DDT (dithiothreito) hoặc 8-hydroxy-quinoline. 8-hydroxy-quinoline tạo cho dung môi hữu cơ có màu vàng sáng dễ phân biệt giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ. Kết tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối để lạnh trước (tủa hầu hết các loại DNA) hoặc tủa bằng isopropanol- chỉ tủa DNA có trọng lượng phân tử cao. Khi tủa, người ta thường sử dụng các muối làm trung hòa điện tích âm của axit amin, thường dùng muối axetate 0,3M. Điều kiện tủa thường ở 40C/30 phút. Ly tâm để lấy phần tủa DNA. DNA thu được được để khô ở nhiệt độ phòng và cho tan trong TE (tris, EDTA) và giữ ở nhiệt độ -4oC. Để bảo quản lâu dài dung dịch DNA được bảo quản ở -20oC. Chú ý: trong quá trình thao tác, phải đảm bảo sạch và vô trùng để tránh lẫn DNA của đối tượng khác dính theo dụng cụ. Tránh các enzym khác phân huỷ DNA hoặc RNA cần nghiên cứu.
1.2.Định tính và định lượng axit nucleic Sau khi tách chiết, axit nucleic được định lượng và kiểm tra độ tinh sạch bằng một trong cácphương pháp sau: Phương pháp đo quang phổ: Trên nguyên tắc sự hấp thu cực đại ánh sáng ở các bước song khác nhau của các bazơ nitơ của các phân tử DNA mạch đơn và mạch kép. Phương pháp thông thường là đo quang phổ. Giá trị mật độ quang thường đo ở bước sóng 260nm (OD 260). Đối với axit nucleic thường viết là A260nm. 1,0 A260nm ~ 50 àg/ml sợi đôi. 1,0 A260nm ~ 33 àg/ml sợi đơn. 1,0 A260nm ~ 40 àg/ml sợi RNA. Khi tính nồng độ DNA cũng cần lưu ý đến hệ số pha loãng của dịch chiết khi đo. Công thức tính chung đối với DNA sợi đôi là CDNA (àg/ml) = A260nm x 50 x độ pha loãng. Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch DNA, thường đo đồng thời giá trị quang phổ hấp thụ ở bước sóng 280nm. Đây là phổ hấp phụ cực đại của protein. Nếu A260nm/ A280nm = 1,8-2,0 thì dịch chiết đủ độ tinh sạch để phân tích. Việc định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của dịch chiết cũng có thể được thực hiện bằng phương pháp điện di.
Điện di DNA Ngoài việc dùng để định tính và định lượng DNA, điện di axit nucleic còn được dùng để phân tích định tính và thu nhận mẫu axit nucleic, dựa trên đặc tính cấu trúc của axit nucleic. Axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm, đồng đều trên khắp bề mặt, do đó khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tuỳ theo kích thước của phân tử DNA mà người ta dùng các loại gel khác nhau: Phân tử DNA có kích thước dưới 500 đôi Nu: dùng polyacrylamid. Vai trò của enzym cắt ở vi khuẩn: ở vi khuẩn enzym cắt có vai trò phân giải DNA của virus khi virus xâm nhập vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn có enzym biến đổi để methyl hoá enzym cắt làm cho enzym cắt mất hoạt tính, không tác động đến DNA của vi khuẩn. Phân đoạn DNA: người ta dùng enzym cắt để cắt các phân tử DNA dài thành các đoạn nhỏ. Sau khi bị cắt, các đoạn DNA có thể được điện di trên agarose gel để xác định tính chất, hoặc dùng để tạo nên các phân tử DNA lai. Có ba nhóm RE: Nhóm I: Khi enzym nhận biết được trình tự sẽ di chuyển dọc theo DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 Nu và giải phóng vài chục Nu. Nhóm II: nhận biết được trình tự và cắt ngay tại vị trí đó; Nhóm III: nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng vài chục Nu. Trong kỹ nghệ di truyền enzym nhóm II thường được sử dụng. Phân tử DNA có kích thước 500 - 10000 đôi Nu: dùng agarose. Agarose là một loại polymer tách từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6 anhydro-L-galactose. Phân tử DNA có nhiều đôi Nu hơn: dùng agarose gel có lỗ to hơn (Pulsel field agarose gel). Tốc độ di chuyển phụ thuộc kích thước phân tử, dạng cấu trúc DNA, nồng độ gel, điện thế, nhiệt độ, thành phần chất đệm điện di. Khi cho chạy điện di DNA cần nghiên cứu thường có thang DNA chỉe thị mẫu (marker-ladder) cùng chạy để so sánh. Thang DNA là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết. Thông thường người ta dùng thang DNA là thực khuẩn thể ở được thủy giải bởi enzym giới hạn Hind III.
còn nữa Sưu tầm | |